Techniky rekombinantných DNA

Technológia rekombiantnej DNA bola objavená Herbertom Boyerom a Stanley Cohenom v roku 1973 a znamenala prevrat v metodických prístupoch dotýkajúcich sa všetkých biologických vied. Rekombinantné DNA boli kľúčové nielen pre väčšinu významných objavov v biomedicínskych vedách za ostatných 30 rokov, ale s ich nástupom začala aj éra nových biotechnológií. Za významné považujeme aj to, že sa na Slovensku podarilo zachytiť tento trend a už v roku 1982 boli pripravené prvé rekombinantné DNA na Ústave molekulárnej biológie SAV a Prírodovedeckej fakulte UK.
Koncom 60. a začiatkom 70. rokov prispeli k objavom najmä Jeff Schell, Marc Van Montagu, Mary-Dell Chilton a Ernie Jaworski. V prvej polovici 80. rokov sa potom podarilo vďaka rozvoju molekulárnej biológie upraviť prirodzené Ti-plazmidy tak, že namiesto génov vyvolávajúcich rastlinné choroby mohli byť vložené gény dávajúce rastlinám poľnohospodársky užitočné vlastnosti. Prvou transgénnou rastlinou bol v roku 1983 tabak s rezistenciou na kanamycín a už v roku 1987 boli skupinou Rogera Beachyho úspešne vykonané poľné pokusy prvej poľnohospodárskej plodiny – rajčiakov odolných proti vírusu TMV (vírus tabakovej mozaiky).
Liečivá ako ľudský inzulín, interferón, rastový hormón, erytroprotein, ale aj biologicky aktívne prášky sú súčasťou nášho bežného života. Väčšina užívateľov si ani neuvedomuje, že ich produkcia je založená na rekombinantných DNA. Pomaly, ale isto sa súčasťou aj našich potravín stávajú komponenty pochádzajúce z geneticky modifikovaných plodín.

Význam techník rekombinantných DNA

Nielen v oblasti molekulárnej biológie, ale aj v bežnom živote sa v súčasnosti často stretávame s pojmami génové manipulácie, génové inžinierstvo, klonovanie génov, techniky rekombinantných DNA či technológia rekombinantných DNA. Nebudeme si pripomínať, čo všetko podmienilo, že biologické vedy dosiahli úroveň, keď je bežná práca s DNA, s génmi, keď môžeme tvoriť ich kombinácie, ktoré príroda nepoznala. Pokúsime sa najprv objasniť, čo je obsahom uvedených pojmov. Zdôrazňujeme, že ich obsah sa vo veľkej miere prekrýva. Vznikli pred viac ako 30 rokmi, a preto sa ich obsah ešte stále mení, alebo presnejšie povedané, upresňuje.
Pojem génové manipulácie, správnejšie manipulácie s génmi, zvýrazňuje aspekt tvorby nových kombinácií genetického materiálu tým, že sa gény vo forme ich materiálneho nosiča – DNA môžu pomocou vektorov prenášať do iných organizmov, kde sa pôvodne vôbec nemuseli vyskytovať. Génové manipulácie nemusia zákonite vychádzať z prípravy rekombinantných molekúl in vitro. Tento druh génových manipulácií sa niekedy označuje aj ako génové manipulácie (inžinierstvo) in vivo. Ku génovým manipuláciám v širšom zmysle slova môžeme zaradiť aj procesy ako napríklad konjugácia, transdukcia, transpozícia a ďalšie.
Pojem génové inžinierstvo je veľmi blízky pojmu génové manipulácie. Zdôrazňuje viac aspekt cieľového projektovania, konštruovania, „inžinierstva“ nového genotypu. Tento termín je o niečo užší ako génové manipulácie.
Pojem molekulové klonovanie (klonovanie DNA, klonovanie génov) zdôrazňuje obrovský význam klonovania – rozmnožovania (jednotnej) DNA. Klonovanie umožňuje rozmnoženie jednej molekuly DNA na ľubovoľný počet molekúl (čím je vlastne úplne separačnou technikou) a umožňuje aj deliť jednotlivé molekuly (aj keď len DNA) navzájom.

Pod pojmom techniky rekombinantných DNA rozumieme súbor pracovných postupov (metodík), ktoré sú potrebné na prípravu, analýzu a zmenu rekombinantných DNA. Génové manipulácie, génové inžinierstvo a klonovanie DNA sa vlastne realizujú prostredníctvom rekombinantných DNA.
Pojem technológia rekombinantných DNA sa v mnohom stotožňuje s pojmom techniky rekombinantných DNA, zdôrazňuje však štandardnosť celkového postupu práce s rekombinantnými DNA. Dáva ich na úroveň výrobného procesu (vyrábajú sa rekombinantné DNA).
Rozvojom techník rekombinantných DNA sa začala nová, kvalitatívne vyššia etapa v molekulovej biotechnológii. Komerčné uplatnenie týchto techník sústredilo obrovský kapitál na ich využitie, čo spätne urýchlilo ich rozvoj.

Základné etapy prípravy rekombinantných DNA

Etapa	Charakteristika postupu
IZOLÁCIA DNA	Pri príprave rekombinantných DNA používame dva druhy DNA – vektorovú DNA a DNA, ktorú analyzujeme, lebo vytvára zdroj vyžadovaných génov. Spravidla je to chromozómová (zriedkavejšie plazmidová, vírusová, fágová alebo organelová DNA). Môžeme ju tiež nazvať donorová DNA. V prípade eukaryotov využívame ako zdroj génov mRNA, z ktorej sa pomocou reverznej transkriptázy získa cDNA (komplementárna DNA), ktorá sa ďalej klonuje.
PRÍPRAVA REKOMBINANTNEJ DNA	Je spojenie vektorovej a donorovej DNA. In vitro sa môže robiť spojením pomocou DNA-ligázy alebo spojením cez homologické jednovláknové úseky, ktorými sú jednotlivé DNA zakončené. Tieto jednovláknové homopolyméry sa volia tak, aby vektorový úsek bol komplementárny k úseku donorovej DNA. Druhý spôsob sa dnes prakticky používa len pri príprave cDNA.
SELEKCIA REKOMBINANTOV	Je oddelenie rekombinantných DNA od nerekombinantných, čiže „čistých vektorov“. Dnešné vektorové systémy sú konštruované veľmi dômyselne a rozlíšenie rekombinantov osobitne v E. coli nie je zložité.
ANALÝZA REKOMBINANTOV	Je výber hľadaného rekombinantu z veľkého množstva ostatných rekombinantov. Tento krok je väčšinou najzložitejší, v súčasnosti však existujú všeobecné postupy analýzy rekombinantov.
ANALÝZA ALEBO ÚPRAVA KLONOVANEJ DNA	Rekombinantná DNA, ktorá obsahuje funkčné gény, ale aj nefunkčné úseky DNA, je obyčajne cenným zdrojom informácií. Pri jej analýze sa obyčajne upresnia restrikčné mapy klonovanej DNA. Ak sa klonoval funkčný gén, zvyčajne sa upresní jeho poloha, analyzuje sa jeho okolie, najúplnejšiu informáciu však poskytne určenie primárnej štruktúry (sekvencie). Na základe získaných informácií sa často pristúpi k zmene (úprave) rekombinantu, napr. sa skráti veľkosť fragmentu tak, aby obsahoval len vyžadovaný gén, upravia sa niektoré regulačné časti génu – promótor, operátor a ďalšie, fragment DNA sa na zlepšenie expresie reklonuje v inom vektore, použije sa cielená mutagenéza atď. Analýza rekombinantných DNA je často posledných štádiom práce s rekombinantmi. Nie vždy je cieľom prenos génu do iného organizmu.
PRENOS REKOMBINANTNEJ DNA DO CIEĽOVÉHO ORGANIZMU	Má význam z dvoch aspektov: a. bunka získa vlastnosti, ktoré dovtedy nemala, alebo sa aspoň zmení kvantitatívna vlastnosť génu (najmä v dôsledku zvýšenia génovej dózy), čo má význam pre niektoré biotechnologické aplikácie, b. získajú sa informácie o správaní sa modifikovaných alebo nových génov v určitom organizme, čo má význam napr. pri sledovaní regulácie génovej expresie, bunkových procesov ako replikácia, rekombinácia, reparácia, transpozícia a ďalších.

Prenos rekombinantov do jednotlivých druhov organizmov je bezprostredne spojený s existenciou vhodných klonovacích vektorov. Väčšina analytických metód prípravy rekombinantných DNA je rozpracovaná pre E. coli.